Real Decreto 2021/1993, de 19 de noviembre, por el que se aprueba un método oficial de análisis de leche y productos lácteos.

Pesar 2,000 g ± 0,001 g y añadir 20,0 g de agua a 50 ºC. Disolver agitando durante cinco minutos con ayuda de un agitador. Llevar a temperatura de 25 ºC. Añadir en dos minutos 10,0 ml de la solución de ácido tricloroacético (3.1) bajo agitación magnética.

Mantener a 25 ºC durante sesenta minutos. Centrifugar a 2.200 ges durante diez minutos o filtrar sobre papel desechando los cinco primeros ml de filtrado.

b) Leche líquida.

Tomar 20 ml de leche y continuar el proceso de igual forma a la que figura a partir del segundo punto y seguido del párrafo segundo del apartado a).

c) Patrones.

Aplicar exactamente a la leche en polvo (3.4.a) y a la leche en polvo adicionada con el 5 por 100 de suero de quesería (3.4.b) el procedimiento descrito en el apartado 4.1.a.

1. Análisis cromatográfico.

a) Inyectar de 15 a 30 µl medidos exactamente de sobrenadante o de filtrado obtenido según el apartado 4.1 en el aparato de cromatografía líquida de alta eficacia con un flujo de 1,0 ml/min de la solución eluyente (3.2).

En cada interrupción lavar las columnas con agua y en toda interrupción superior a veinticuatro horas, después del lavado con agua, se les debe pasar solución de lavado (3.3) por lo menos tres horas a un flujo de 0,2 ml por minuto o seguir las instrucciones del fabricante.

b) Antes de proceder al análisis cromatográfico de las muestras, inyectar el patrón de leche en polvo adicionada con el 5 por 100 de suero de quesería (3.4.b) preparado según el apartado 4.1.c) las veces que sean necesarias hasta que la superficie y el tiempo de retención del pico correspondiente a los GMP sea constante.

1. Cálculos.

1. En las figuras 1 y 2 se representan los cromatogramas de una leche en polvo exenta de suero de quesería (3.4.a) y de la misma leche en polvo adicionada con el 5 por 100 (m/m) de suero de quesería (3.4.b), respectivamente. El pico III es el correspondiente a los GMP.

Con el fin de detectar cualquier anomalía, ya sea debida al mal funcionamiento del cromatógrafo o de las columnas, ya sea debido a la muestra a analizar, es necesario observar el aspecto de cada cromatograma antes de efectuar cualquier interpretación cuantitativa.

1. Cálculo del coeficiente de respuesta:

donde:

R: es el coeficiente de respuesta.

A(5): es el área del pico III obtenido en el análisis cromatográfico del patrón de leche en polvo adicionada con 5 por 100 (m/m) de suero de quesería (3.4.b).

A(0): es el área del pico III, obtenido en el análisis cromatográfico del patrón de leche en polvo exenta de suero de quesería (3.4.a).

P: es el porcentaje de suero de quesería presente en el patrón (3.4.b), en este caso 5.

1. Cálculo del área relativa del pico III obtenido en el análisis cromatográfico de la muestra (E).

S(E) = R × A(E)

donde:

S(E): área relativa del pico III en la muestra (E).

A(E): área correspondiente al pico III obtenida en el análisis cromatográfico de la muestra.

R: Coeficiente de respuesta calculado según (5.2).

1. Cálculo del área relativa del pico III obtenido en el análisis cromatográfico del patrón de leche en polvo exento de suero de quesería (3.4.a).

S(O) = R × A(O)

donde:

S(0): área relativa del pico III en el patrón de leche en polvo exenta de suero de quesería (3.4.a).

A(0): área correspondiente al pico III obtenido en el análisis cromatográfico del patrón de leche en polvo exenta de suero de quesería (3.4.a).

R: coeficiente de respuesta calculado según (5.2).

1. Cálculo del tiempo de retención relativo del pico III en la muestra (E).

donde:

TRR(E): tiempo de retención relativo del pico III de la muestra (E).

TR(E): tiempo de retención del pico III obtenido en el análisis cromatográfico de la muestra (E).

TR(5): tiempo de retención del pico III obtenido en el análisis cromatográfico del patrón de leche en polvo adicionada con 5 por 100 (m/m) de suero de quesería (3.4.b).

1. Por la experimentación, está demostrado que existe una relación lineal entre el tiempo relativo del pico III en la muestra y el porcentaje de suero de quesería en polvo añadido hasta el 10 por 100:

– Con un contenido < 5 por 100, el TRR(E) es > 1,000.

– Con un contenido ≥ = 5 por 100, el TRR(E) es ≤ 1,000.

– La incertidumbre admitida para los valores del TRR(E) es de ± 0,002.

1. Cálculo de porcentaje de suero de quesería en polvo presente en la muestra.

W = S(E) - [1,3 + (S(O) -0,9)]

donde:

W: porcentaje m/m de suero de quesería presente en la muestra (E).

S(E): área relativa del pico III para la muestra obtenida según (5.3).

1,3 +: media experimental del área relativa del pico III expresada en gramos de suero de quesería en 100 g de leche en polvo no adulterada.

S(0): área relativa del pico III para el patrón de leche en polvo exenta de suero de quesería (3.4.a) obtenida según (5.4).

(S(0) – 0,9): corrección que hay que efectuar en el área relativa media 1,3 cuando el valor S(0) no es igual a 0,9.

1. Repetibilidad.

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o en un corto intervalo de tiempo por el mismo analista que utilice los mismos aparatos, con la misma toma de muestra, no debe sobrepasar el 0,2 por 100 m/m.

1. Reproducibilidad.

La diferencia entre dos resultados individuales e independientes obtenidos en dos laboratorios diferentes, con la misma toma de muestras no debe sobrepasar el 0,4 por 100 m/m.

1. Límite de detección.

Se considerará que una muestra contiene suero de quesería añadido cuando el porcentaje cuantificado sea superior a cinco en el caso de leches UHT y superior a tres en leches pasteurizadas, esterilizadas y en polvo.

1. Referencias.

1. «Olieman (et al) 1983. A sensitive HPLC method of detecting and stimating rennet whey total soolids in skim milk powder; Neth Milk Dairy J. 37 27-36)».

1. Reglamento CEE número 3711/1986, de la Comisión, de 4 de diciembre de 1986.